[HPLC의 원리] HPLC 원리와 응용

안녕하세요.
저는 현재 화학계열 회사에서 일을 하고 있는 직장입니다.
졸업생들이라면 필수적으로 다뤄야 하는 HPLC의 원리와 응용하는 방법에 대해 설명해 보겠습니다.

HPLC란 무엇인가?
High Performance Liquid Chromatography의 약자로 고성능 액체 크로마토그래피란 뜻입니다. 가장 대중적으로 사용하는 분석 기법이자 장비이며 화학을 전공하는 분들에게는 필수템입니다. 화학계열 회사에서 종사하신다면 거의 무조건 쓰실 겁니다.

기기의 사용 목적은 미지시료 혹은 알고 있는 시료의 정성, 정량분석을 하기 위해 사용합니다. HPLC에 가장 큰 장점은 분석물질을 신속하고 정확하게 그리고 재현성 있게 분석할 수 있기 때문에 대중적으로 가장 사랑받는 장비이며 다른 분석기기 장비들에 비해 많이 쓰이고 있고, 점점 더 업그레이드 되고 있습니다.

자 그럼 본론으로 넘어가 보겠습니다.

HPLC를 사용하는 목적이 정성, 정량 분석이라고 했는데 두가지의 차이는 매우 중요합니다.

정량분석(quantitative analysis)은 이름 그대로 양을 측정하는 것입니다. 예를 들어서 타이레놀을 녹여서 분석한다고 할 때 타이레놀 안에 있는 주성분인 아세트아미노펜이 얼마나 들어있는지 측정하는 것 정량분석입니다.
정성분석(qualitative analysis)은 이름에 나와있듯이 성분을 확인하는 것입니다. 타이레놀을 분석 했을 때 어떤 성분이 들어있는지, 혹은 주 성분인 아세트아미노펜이 포함되어 있는지를 확인하는 것이 정성분석입니다.

이 둘의 차이를 잘 알고 넘어가셔야 합니다.

그럼 HPLC에서 가장 중요한 원리에 대해 알아보겠습니다.
가장 중요 한 건 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서 Chromatography 부분입니다. 크로마토그래피의 원리만 이해한다면 HPLC의 80%는 이해했다고 될 것 같습니다.
크로마토그래피 원리를 이해하는데 필요한 용어부터 알아보겠습니다.

• 정지상 (stationary phase) : 모세관이나 컬럼에 충진되서 움직이지 않고 용질과 상호작용을 하는 물질
• 이동상 (mobile phase) : 정지상을 통과하는 액체(분석 장비에 따라 기체, 초임계유체 등으로 바뀔 수 있음)
• 정상 (normal phase, NP) : 정지상이 극성으로 충진되어 있으며, 이동상은 상대적으로 비극성인 것을 사용
• 역상 (reversed phase, RP) : 정지상이 비극성으로 충진되어 있으며, 이동상은 상대적으로 극성인 것을 사용
• 용리 (elution) : 크로마토그래피에서 시료 성분이 정지상 및 이동상과 상호작용을 하며 분리되어 유출되는 과정
• 머무름 시간 (retention time) : 분석 물질이 주입된 후 용출될 때까지 걸린 시간(즉 정지상에 머무른 시간)

크로마토그래피의 원리
간단히 말해서 정지상과 분리하는 성분들간의 상호작용입니다. 분리하려는 성분들이 정지상과 친화력이 크면 오래 머무를 것이고, 친화력이 낮다면 머무리지 않고 용출되어 나올 것입니다. 이를 이용해서 혼합물이 똑같이 출발하지만 친화력 차이에 의해 이동속도가 달라져 혼합물들을 분리할 수 있는 것입니다. 여기서 말하는 친화력이란 극성-비극성, 양전하-음전하, 입자 크기 등 다양하게 존재하고 충진되어 있는 정지상이나 분리목적에 따라 다양하게 선택할 수 있습니다.

HPLC의 모식도

위에 그림은 대중적으로 사용하는 HPLC의 모식도입니다.

간단히 말해서 Liquid Sample(분석하려는 물질)을 Column(정지상)으로 주입을 하게 되는데 Pump의 힘을 이용해 Mobile Phase(이동상)를 흘려주어 정지상을 통과시키는 장비입니다. 그 이후의 정성분석, 정량분석의 역할은 Detector가 하게 되는 것이죠. 가장 대중적으로 사용하는 Detector장비는 UV입니다. 대부분의 분석하려는 물질의 흡수파장 영역대가 200~400nm 부근이며 속도가 빠르고 정확하다는 장점을 가지고 있기 때문에 UV를 많이 씁니다.

HPLC를 잘 다루기 위해서는 기계의 작동원리와 모식도들도 잘 이해하면 좋겠지만 사실 학교 분석실 같은 곳에서 직접 눈으로 보는게 이해하기 쉽고 직접 다뤄보는게 가장 좋습니다.
그렇기 떄문에 HPLC에 가장 중요한 것은 컬럼안의 정지상, 이동상, 분석물질 간의 특성들을 이해하는게 가장 좋을 것 같습니다. 그것은 바로 아까도 말씀드린 크로마토그래피의 원리 입니다.

그럼 이해하기 쉽게 HPLC 분석의 실제 예를 보여드리겠습니다.

실제로 HPLC 분석을 하게 되면 위와 같은 결과 값이 나오게 됩니다. 이것 역시 크로마토그래피 원리의 결과 값이며 봉우리처럼 나온 것을 Peak 라고 합니다. 똑같은 5개의 혼합물질이라도 이동상을 흘려주는 속도에 따라 머무름 시간이 다른 것을 확인 할 수 있습니다.

2번과 3번이 붙어 있는 것이 보이시나요? 그러나 속도가 늦을수록 간격이 벌어지는 것을 확인 할 수 있습니다. 2번, 3번을 완벽하게 분리하기 위해서는 속도를 조절하는 방법도 있지만 정지상의 성질과 이동상을 이용해서도 더 쉽게 분리 할 수 있습니다.

퀴즈형식으로 설명해드리겠습니다.

정지상이 비극성으로 충진 되어 있을 때(역상크로마토그래피) 2번과 3번중에 극성이 더 큰 물질은? (이동상은 메탄올:물 = 50:50 비율이라고 가정하겠습니다)
정답은 2번 입니다.
이유는 아까도 말씀드렸듯이 정지상(비극성)과 친화력이 높은 것은 비극성일 것이고 친화력이 높높다는 것 오래 머무른다는 것을 의미합니다. 따라서 머무름 시간이 더 긴 3번이 2번보다 상대적으로 비극성인 것입니다. 따라서 2번이 극성이 더 큰 것이지요.

자 그렇다면 정지상은 바꾸지 않고 이동상의 조성비를 이용해서 2번과 3번의 분리도(Peak 간격)을 더 넓히는 방법은?
정답은 이동상을 더 극성 용매로 바꾸는 것입니다.

용매조성 메탄올:물 =50:50에서 메탄올:물 = 40:60으로 바꾸게 되면 물의 비율이 높아져서 이동상의 극성도가 높아집니다. 그렇다면 극성도가 상대적으로 높은 2번 물질을 더 빨리 이동시켜서 컬럼안에 머무름 시간을 짧게 만들고 극성도가 적은 3번물질이 상대적으로 오래 머물게 되어 분리의 차이를 발생시키게 됩니다.

위처럼 정지상의 충진재, 이동상의 성분, 분리물질 혹은 분리 목적만 알면 여러 조건들을 적용하여 혼합물을 분리할 수 있는 것이 HPLC입니다.

다들 이해 가셨나요?

궁금한 것은 댓글로 달면 설명해드리겠습니다.